学术成果 | VEGFR2+CTC：新型肝癌靶向治疗预测位点及靶向抑制剂探索

循环肿瘤细胞(CTC)是从原发肿瘤部位分离并进入血液循环，是驱动癌症转移的关键因素，与肿瘤复发转移密切相关，作为液体活检的首选样本，为监测肿瘤转移、评估治疗反应和预后提供了一种方便、有效的方法。在许多其他癌症中，外周血中CTC的计数已被证明是肿瘤患者的独立预后指标。

CTC通过上皮-间质转化(EMT)机制穿透血管壁进入到血液中，其中血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)是VEGF的关键受体，是血管生成的必要条件，其在肝癌(HCC)肿瘤组织中表达典型地上调。多项研究报道了VEGFR2在乳腺癌、肺癌和结肠直肠癌CTC中的表达，提示VEGFR2可能在CTC生物学功能中发挥重要作用^[1]。然而，在HCC-CTC中VEGFR2表达的机制尚不清楚，探索VEGFR2在CTC中的表达、与CTC的形成等相关机制，有助于开发新的肝癌靶向治疗疗效预测工具。

近日，四川省人民医院肝胆外科、肿瘤科联合四川大学华西医院生物治疗与癌症中心国家重点实验室基于CanPatrol^® CTC分型检测技术平台^[2]，研究VEGFR2在HCC CTC中的表达，结合各项基础实验，探索VEGFR2在HCC癌细胞侵袭、转移和CTC形成的相关机制研究，并发现槲皮素(一种类黄酮，在HCC中，槲皮素可以抑制细胞周期进程，触发细胞凋亡，槲皮素通过抑制VEGFR2的表达及其磷酸化，具有众所周知的抗血管生成作用)可减少VEGFR2 mRNA通过内皮细胞向HCC细胞的转移，降低了CTC和VEGFR2阳性CTC的比例，或可成为VEGFR2+CTC的靶向治疗抑制剂。

● 研究题目：槲皮素通过减少细胞外囊泡介导的VEGFR2 mRNA抑制肝细胞癌细胞转移

● 发表期刊：Molecular Carcinogenesis（医学二区）

● 合作单位：四川省人民医院、四川大学华西医院生物治疗与癌症中心国家重点实验室

● PMID：39171838

研究方法

本研究结合了生物信息学分析、HCC原发性肿瘤内皮细胞(PTECs)的分离、细胞系的培养、慢病毒感染、ELISA、免疫荧光染色 (IF)和荧光原位杂交(FISH)、蛋白印迹分析、外泌体蛋白(EVs)体外追踪、Transwells实验、RT-PCR、异种移植肿瘤研究等相关实验。

CTC检测技术采用CanPatrol^® CTC可视化液体活检平台对外周血中CTC进行分离鉴定及EMT分型分析。该技术采用不依赖特定标志物的纳米膜分离方法，全面富集所有类型的CTC及CTC细胞团；通过多重mRNA荧光原位杂交法，即使用多组上皮、间质和CD45、VEGFR2探针，同步实现CTC的EMT分子分型和相关基因的表达检测。

研究结果

▎HCC的CTC中可检测到VEGFR2 mRNA表达

研究收集了19例HCC患者的334例CTC，包括50例上皮型CTC、1例间质型CTC和283例混合型CTC。在41/50(82%)上皮型CTC患者和257/283(90.8%)混合型CTC中观察到VEGFR2阳性表达，包括低、中、高表达。

这些发现表明，VEGFR2的表达在HCC-CTC中很常见。基于这一观察结果，研究人员推测VEGFR2 mRNA可能并不仅仅来源于HCC细胞内的从头转录，而是可以从肿瘤微环境(TME)中获得。

▲图1 HCC-CTC中VEGFR2的表达情况

▎VEGFR2与肝癌肿瘤细胞表达差异

-在人类癌细胞系的转录组数据中分析VEGFR2在HCC癌细胞系中的表达谱，在纳入的HCC细胞系中，只有JHH-2和SNU-182的VEGFR2表达量高于log2(TPM+1)>1 (图2A)；

-基于免疫组化结果，发现在血管细胞中VEGFR2表达阳性，而在HCC肿瘤细胞中普遍表达阴性，但在穿透血管的细胞(可能包括肿瘤细胞)显示VEGFR2染色阳性(图2B，红色箭头)；

-内皮细胞和成纤维细胞的VEGFR2表达最高，而其他细胞类型，包括巨噬细胞和肝细胞的VEGFR2表达有限但可检测到(图2C)；

-人肝纤维化和HCC组织中VEGFR2单细胞RNA水平的基因表达对比发现，在一些肝细胞中，包括HCC肿瘤细胞中检测到HCC TME，VEGFR2mRNA(图2D，红色圆圈)

基于这些发现，研究推测HCC肿瘤细胞可能在向CTC过渡的过程中通过与血管细胞的相互作用获得VEGFR2 mRNA。

▲图2 VEGFR2在不同细胞中的表达差异

▎HCC肿瘤细胞可通过原发肿瘤内皮细胞来源的细胞外囊泡获得VEGFR2 mRNA

在进入循环并成为CTC的过程中，HCC肿瘤细胞与内皮细胞(ECs)密切相互作用。来自内皮细胞的胞外囊泡(EVs)可能将mRNA传递到受体细胞。因此，研究推测CTC中的VEGFR2 mRNA可能来自于内皮细胞分泌的EV。为了验证这一假设，研究从HCC组织中分离出了原代肿瘤内皮细胞(PTECs)。

PTEC衍生的EV可以被HCC细胞内化，并定位于核周腔室，FISH实验观察到VEGFR2 mRNA表达，Huh-7和SK-HEP-1与来自PTECs的ev共培养后，细胞质中可检测到VEGFR2mRNA。结合免疫组织染色、慢病毒实验、RT-QCR等多个实验，证实了这一假设。

▲图3 HCC肿瘤细胞可通过PTECs衍生的EVs获得VEGFR2 mRNA

槲皮素可以通过抑制VEGFR2 mRNA的表达和VEGFR2蛋白的磷酸化来抑制多种类型肿瘤的血管生成，本实验研究还发现，在PTECs中，槲皮素处理以剂量依赖性的方式降低了VEGFR2 mRNA的表达(图3G)。与对照组相比，经槲皮素处理的PTECs的EV的VEGFR2 mRNA载量也显著降低(图3I)。用槲皮素处理的PTECs EV的受体HCC细胞VEGFR2 mRNA水平显著低于未处理PTECs的HCC细胞(图3M，N)，再次证实了槲皮素可以抑制VEGFR2 mRNA表达。

▎HCC肿瘤细胞可通过原发肿瘤内皮细胞来源的细胞外囊泡获得VEGFR2 mRNA

IF染色和流式细胞仪分析证实，与EVs-shNC共培养12h后，HCC细胞的细胞膜中存在VEGFR2蛋白(图4A，白色箭头，图4B，C)。然而，在与槲皮素-shVEGFR2或来自槲皮素处理的PTECs的ev共培养的HCC细胞中，这种现象明显减弱(图4A−C)。

▲图4 槲皮素抑制HCC肿瘤细胞中VEGFR2蛋白的表达

▎槲皮素削弱vegfr2介导的，并增强HCC细胞的侵袭、转移和CSC特性

前面的研究证实了槲皮素可以减少EV介导的VEGFR2 mRNA从PTECs向HCC细胞的转移，研究继续评估了槲皮素是否通过VEGFR2抑制HCC细胞的恶性行为。通过流式细胞仪分析、肿瘤球体形成实验等，发现槲皮素治疗显著损害了VEGFR2过表达和VEGF刺激诱导的CSC特性(图5C−H)。

▲图5 槲皮素削弱vegfr2介导的，并增强HCC细胞的侵袭、转移和CSC特性

▎槲皮素减少异种移植瘤模型中VEGF分泌和VEGFR2阳性CTC

-qPCR和ELISA数据显示，与载体对照相比，过表达VEGFR2的Huh-7和SK-HEP-1细胞均增强了VEGF mRNA转录和更多的VEGF分泌，而槲皮素治疗大大抑制了这些趋势(图6A，B0。

-试管形成实验显示，与培养基对照相比，来自Huh-7和SK-HEP-1细胞的CM均显著促进了PUMC-HUVEC-T1细胞的试管形成能力，VEGFR2的过表达显著增强了这些作用，但同时槲皮素处理减弱了这些作用(图6C，D)。

-使用裸鼠生成huh-7来源的异种移植瘤模型，结果显示这些过表达VEGFR2的肿瘤细胞系的生长速度明显更快(图6E，F)，肿瘤内的血管形成更强(图6G)。槲皮素治疗大大削弱了这些趋势(图6E−G)。

▲图6 槲皮素减少移植瘤模型中VEGF分泌和VEGFR2阳性CTC

研究结论

VEGFR2在HCC的CTC各个亚型中存在差异性表达，且VEGFR2与肝癌CTC形成密切相关，研究发现，槲皮素通过抑制内皮细胞中VEGFR2的表达，减少VEGFR2 mRNA通过内皮细胞向HCC细胞的转移。从功能上讲，槲皮素可损害VEGFR2介导的肝癌细胞侵袭、转移、CSC特性、血管生成和异种移植物生长的增强模型。此外，槲皮素治疗降低了CTC和VEGFR2阳性CTC的比例，槲皮素或可作为一种靶向VEGFR2抑制HCC进展的抑制剂，为HCC靶向CTC治疗临床研究提出更多可能性，贡献了丰富的研究数据。

展望

本研究基于CanPatrol^® CTC可视化液体活检平台，完成了CTC中目标基因mRNA在不同EMT分型中的探索，并联合多项前沿的基础研究，实现目标基因与肿瘤细胞转移、迁徙的机制探索，可大大的丰富基于CTC技术的下游科研应用，为临床和科研工作者提供了更多研究思路和科研成果转化。

参考文献：

1.Huang Q, Li S, Hu X, et al. Shear stress activates ATOH8 via autocrine VEGF promoting glycolysis dependent‐survival of colorectal cancer cells in the circulation. J Exp Clin Cancer Res. 2020;39(1):25.

2.Quercetin inhibits endothelial & hepatocellular carcinoma cell crosstalk via reducing extracellular vesicle-mediated VEGFR2 mRNA transfer.