学术成果 | 循环肿瘤细胞EMT分型检测：局部晚期鼻咽癌预后评估新指标

鼻咽癌(NPC)是一种起源于鼻咽黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，在流行病学、病理学、临床表现和治疗反应方面表现出不同的特征^[1,2]。目前的指南提倡多学科治疗策略，放射治疗是首选治疗方法^[3,4]，尽管如此，仍有约20%的患者在接受治疗后可能出现复发或远处转移^[5-7]。因此，准确评估肿瘤疾病状态，预测鼻咽癌治疗后复发转移迹象以施以相应治疗手段极其重要。

循环肿瘤细胞(CTCs)检测是一种重要的液体活检方法，CTCs通过上皮-间质转化(EMT)过程参与肿瘤细胞远处播散和转移，最终促进肿瘤转移并导致不良预后，通过CTCs表型检测进行全面评估，对深入鼻咽癌的临床相关性至关重要。

近日，广西医科大学第一附属医院放疗科基于CanPatrol^® CTC分型检测技术平台对CTCs的计数、EMT分型进行检测与局部晚期鼻咽癌(laNPC)临床特征和患者预后相关性进行了研究探索^[8]。

01 纳入人群

本回顾性研究纳入2018年11月至2021年11月期间接受治疗的141例鼻咽癌患者。

▎纳入标准：a.经病理证实的鼻咽癌诊断；b.根据UICC/AJCC指南第8版分期为III 、IVa期; c.完成放化疗；d.年龄:18至70岁之间；e.之前没有接受过抗肿瘤治疗或其他恶性肿瘤治疗；f.诺夫斯基表现得分≥70；g.治疗前、后完成两次CTCs检测。

▎排除标准：a.患有严重基础疾病的患者无法耐受治疗；b.因各种原因中断放射治疗，无法按计划进行随访。

02 研究方法

分别在治疗前、治疗后，使用EDTA抗凝采血管，采集两管5ml外周血，采用CanPatrol^® CTC可视化液体活检平台对外周血中CTCs进行分离鉴定及EMT分型分析。该技术采用不依赖特定标志物的纳米膜分离方法，全面富集所有类型的CTCs及CTC细胞团；通过多重mRNA荧光原位杂交法，使用多组上皮、间质和CD45探针，对富集的CTCs进行EMT分型和鉴定，实现CTCs的EMT分子分型检测。

▲图1 不同EMT亚型CTCs的荧光显微图像

a: 上皮型CTCs; b: 混合型CTCs; c: 间质型CTCs

03 随访

本研究随访至2023年10月1日。患者在治疗结束后，两年内每三个月定期随访一次，随访常规检查包括身体评估、血液生化分析、鼻咽镜检查、鼻咽和颈部MRI扫描、胸部CT扫描、腹部CT扫描或超声波检查以及心电图。如果发现任何异常，应进行进一步调查，如活组织检查或PET/CT扫描。

04 统计分析

使用SPSS 27.0和R语言4.1.2进行统计分析。通过非参数秩和检验对非正态分布的计数数据进行评估、Kaplan-Meier分析评估生存曲线，并采用对数秩检验进行比较，Cox回归模型进行单变量分析，P<0.05为显著性差异。

05 研究结果

1 患者的临床病理特征

研究共入组141名laNPC患者，其中96名男性和45名女性，年龄17-69岁(中位46岁)。根据UICC/AJCC TNM第8版分期标准，III期79例，IVa期62例。N期分类：20例患者为N1，86例为N2，35例为N3，T期分类显示4例患者为T2，85例为T3，52例为T4。141例患者均为M0，表明没有转移。按(EBV)DNA检测的阈值≥400拷贝^[9]为阳性标准，57例阳性、84例阴性。与此同时，94例患者接受诱导化疗。

由于间质CTCs的高度恶性，将患者分为两组：间质CTCs阳性组和间质CTCs阴性组。通过组间分析发现，治疗前间质型CTCs与N期(P<0.01)和TNM临床期(P=0.02)相关。治疗后间质型CTCs与N期相关(P=0.02)。性别、年龄、T分期、EBV DNA和诱导化疗之间没有显著关系。

表1 鼻咽癌患者的临床特征

2 CTC EMT亚型分布

在141名患者中，总共检测到1365个CTCs，其中混合型CTCs(641，47%)占比最大，其次是上皮型CTCs(464，34%)，间质型CTCs(260，19%)占比最低(图2)。

▲图2 CTCs EMT亚型分布

3 CTCs EMT亚型与预后相关性

对141名患者进行随访研究，中位随访时间32个月(随访区间10-58个月)，研究结果显示，3年总生存率为81.5%，发现治疗前、后CTCs数量与预后显著负相关(图3)。

▲图3 治疗前、后CTCs计数及预后相关性

为了进一步精准评估预后，研究分析CTCs-EMT亚型之间的相关性及其对预后的影响。结果表明，治疗前间质型CTCs与较低的总体生存率(OS)显著相关(P=0.03)(图4a)，治疗后也存在相关性(P<0.01)(图4b)。

▲图4 间质型CTCs Kaplan-Meier生存曲线分析

a: 治疗前；b: 治疗后

此外，T分期(HR=2.96，95%CI 1.37-6.35，P=0.01)、N分期(HR=2.29，95%CI 1.18-4.44，P=0.01，P<0.01)、TNM临床分期(HR=3.65，95%CI 1.54-8.69，P<0.01)和EBV DNA(HR=2.75，95%CI 1.1-6.86，P=0.03)与OS均显示显著相关性(图5)，性别、诱导化疗和OS之间没有显著关系。

▲图5 鼻咽癌患者总生存期预后的单因素分析

06 研究结论

该研究结果表明，治疗前、后间质型CTCs以及CTC检出率与分期有关，治疗前、后检出间质型CTCs提示预后不佳，通过CTCs及CTCs EMT分型检测，有助于精准指导局部晚期鼻咽癌患者的个体化治疗和预后评估，对实现鼻咽癌个体化治疗具有重要的临床价值。

参考文献：

1.Chen Y-P, Chan ATC, Le Q-T, Blanchard P, Sun Y, Ma J (2019) Nasopharyngeal carcinoma. The Lancet 394:64–80.

2.Chang ET, Ye W, Zeng Y-X, Adami H-O (2021) The evolving epidemiology of nasopharyngeal carcinoma. Cancer Epidemiol Biomark Prev 30:1035–1047.

3.Bossi P, Chan AT, Licitra L, Trama A, Orlandi E, Hui EP et al (2021) Nasopharyngeal carcinoma: ESMO-EURACAN Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up†. Ann Oncol 32:452–465.

4.(2021) The Chinese Society of Clinical Oncology (CSCO) clinical guidelines for the diagnosis and treatment of nasopharyngeal carcinoma. Cancer Commun 41:1195–1227.

5.Chen Y-P, Liu X, Zhou Q, Yang K-Y, Jin F, Zhu X-D et al (2021) Metronomic capecitabine as adjuvant therapy in locoregionally advanced nasopharyngeal carcinoma: a multicentre, open-label, parallel-group, randomised, controlled, phase 3 trial. The Lancet 398:303–313.

6.Zhang Y, Chen L, Hu G-Q, Zhang N, Zhu X-D, Yang K-Y et al (2019) Gemcitabine and cisplatin induction chemotherapy in nasopharyngeal carcinoma. N Engl J Med 381:1124–1135.

7.Sun Y, Li W-F, Chen N-Y, Zhang N, Hu G-Q, Xie F-Y et al (2016) Induction chemotherapy plus concurrent chemoradiotherapy versus concurrent chemoradiotherapy alone in locoregionally advanced nasopharyngeal carcinoma: a phase 3, multicentre, randomised controlled trial. Lancet Oncol 17:1509–1520.

8.Ting Liu， Jing Liu, Guimei Wang, Chunmei Chen, Lihe He, Rensheng Wang, Chunli Ouyang et al(2024)Circulating tumor cells: a valuable indicator for locally advanced nasopharyngeal carcinoma.Eur Arch Otorhinolaryngol. 2024 May 11.

9.He Q, Zhou Y, Zhou J, Zhao D, Li L, Li X et al (2023) Clinical relevance of plasma EBV DNA as a biomarker for nasopharyngeal carcinoma in non-endemic areas: a multicenter study in southwestern China. Clin Chim Acta.