学术成果 | TROP2是三阴性乳腺癌CTC EMT相关的潜在标志物，可促进肿瘤的迁移和侵袭

导语

在循环肿瘤细胞是恶性肿瘤远处转移的种子，与恶性肿瘤和转移风险有关。肿瘤细胞在转移过程中经历上皮-间充质转化(EMT)，导致不同类型CTC的出现。CTC的实时动态分子和功能分型对于准确指导个性化治疗非常必要。大多数CTC检测系统基于上皮标记物，这些标记物无法检测EMT-CTC。因此，鉴定不同CTC类型的新标志物在临床上具有重要意义。

近日，重庆市肿瘤医院检验科郭变琴教授团队基于CanPatrol^® CTC分型检测技术平台对循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell, CTC)的计数以及上TROP2表达进行研究探索，并在《Molecular Therapy Oncology》杂志发表论文“TROP2 is highly expressed in triple-negative breast cancer CTCs and is a potential marker for epithelial mesenchymal CTCs”。研究发现，滋养层细胞表面抗原2(TROP2)在TNBC组织和肿瘤细胞中高度表达，此外，TROP2可以通过上调EMT标记物来促进TNBC细胞的迁移和侵袭。研究结果表明，TROP2是一种潜在的与EMT相关的新型CTC标记物，为TNBC患者CTC异质性的有效标志物。

研究目的

本研究旨在研究TROP2表达水平和BC细胞的EMT相关生物学行为之间的相关性。同时探讨与经典EMT标记物，TROP2可作为TNBC中CTC的新标记物。

实验方法与研究结果

1 TROP2在TNBC中高度表达，与预后不良有关

基于对来自癌症基因组图谱(TCGA)和RNAseqDB数据库中基因型组织表达(GTEx)的一致处理的RNA序列数据的分析，TACSTD2基因编码的肿瘤抗原TROP2在正常组织和肿瘤组织之间差异表达最显著的蛋白质(https://github.com/mskcc/RNAseqDB)^[1]。

如图1A所示，与邻近的正常乳腺组织相比，来自TACSTD2基因的TROP2在BC组织中的转录表达显著更高。此外，TROP2在TNBC中的蛋白表达高于其他BC亚型(图1B)。随后，BC组织切片的IHC结果显示TROP2是在TNBC中显著上调，并与较高的TNM分期呈正相关(图1C和1D)。此外，Kaplan-Meier图显示，TACSTD2表达较高的TNBC患者预后较差(图1E)。这些数据表明，TROP2在TNBC中的表达增加与TNBC患者的预后不良密切相关。

▲图1 TROP2在TNBC中高度表达与预后不良有关

2 TROP2影响肿瘤进展标志物的表达

ER+BC细胞系MCF-7；HER2+BC细胞系SK-BR3；TNBC细胞系MDA-MB231、MDA-MB453、MDA-MB 468和BT549细胞、及正常乳腺上皮细胞MCF-10A，通过qRT-PCR进一步验证TROP2 mRNA表达。

结果与数据库基本一致。与MCF-10A相比，TROP2在MDA-MB468和MDA-MB231细胞中更高表达，但BT549细胞中的表达较低(图2A)。TROP2的表达已被证明有助于肿瘤增殖和迁移。

为了评估TROP2是否影响BC细胞的生物学行为，TROP2在BT549细胞中过表达，并使用相应的慢病毒在MDA-MB231细胞中敲低(图2B)。用qRT-PCR检测这些细胞中的EMT和细胞增殖标志物。TROP2过表达导致波形蛋白、cyclinD1、c-myc和sox2的mRNA表达增加。相反，TROP2敲低导致这些标记物的mRNA表达降低(图2C)。

▲图2 TROP2影响肿瘤进展标志物的表达

3 TROP2通过上调TNBC细胞中的间充质标记物促进侵袭

有证据表明TROP2促进胃癌的侵袭^[2]，为了探索TROP2在TNBC中是否具有相同的功能，对基因表达进行了TCGA数据库分析，以验证我们的假设，即TACSTD2基因与EMT相关分子或信号通路显著相关。TROP2与EMT标记物和转化生长因子b(TGF-b)EMT相关信号通路呈正相关(图3A)。蛋白质印迹结果显示，TROP2的过表达或敲低分别诱导N-钙粘蛋白和波形蛋白的上调和下调(图3B)。此外，伤口愈合测定结果显示，与对照相比，TROP2的过表达显著促进了BT549细胞的迁移。相反，小发夹RNA(shRNA)敲低TROP2显著减弱了MDA-MB231细胞的迁移(图3C和3D)。细胞迁移和侵袭能力的Transwell测定结果表明，TROP2的过表达显著增加了BT549细胞的迁移和侵袭力。相反，TROP2的敲低降低了MDA MB231细胞的迁移和侵袭能力(图3E和3F)。综合以上结果表明，TROP2通过上调EMT促进TNBC细胞的侵袭和迁移，这表明TROP2可以作为EMT相关标志物与其他经典CTC测定标志物结合使用，以提高CTC检测率。

▲图3 TROP2通过上调TNBC细胞中的间充质标记物促进侵袭

4 TROP2在TNBC细胞和血细胞中的表达

TROP2靶向ADC已用于治疗某些类型的实体瘤。针对TROP2的ADC靶点Sacituzumab-govitecan最近被批准用于治疗晚期姑息性TNBC。因此，TROP2可能是检测TNBC中CTC的新标记物。此外，TROP2与经典肿瘤标志物EpCAM属于相同的TACSTD基因家族。为了评估TROP2作为CTC标记的特异性，使用流式细胞术和细胞免疫荧光(IF)来鉴定TROP2和EpCAM在TNBC细胞和MCF-10A中的表达(图4A和4B)。然后通过IF分析它们在来自健康对照的外周血单核细胞(PBMC)中的表达，以确定它们作为CTC的新生物标志物的特异性(图4C)。蛋白质印迹结果还显示TROP2在MCF-10A细胞和PBMC中的低表达或缺失(图4E)。

随后，使用加标测定法测试TROP2对肿瘤细胞捕获和鉴定的潜在适用性。定义将三种类型的TNBC细胞的数量添加到5 mL健康的人外周全血阴性捕获肿瘤细胞富集并通过IF鉴定肌酸激酶单一阳性鉴定中的加标试验(CK)抗体，MDA-MB468、MDA-MB453的回收，以及MDA-MB231细胞分别为19.3%、29.6%和25.6%。在里面CK和TROP2抗体的双阳性检测，恢复分别为16.9%、30.2%和25.3%(图4D)。与先前描述的TROP2在TNBC及其影响EMT的能力，研究结果表明TROP2有可能成为鉴定结果的辅助标记。结果还显示TROP2在MCF-10A中的低表达或缺失细胞和PBMC(图4E)。

随后，使用加标测定法测试TROP2对肿瘤细胞捕获和鉴定的潜在适用性。将确定数量的三种类型的TNBC细胞加入5mL健康人外周血中，通过负富集捕获肿瘤细胞并通过IF进行鉴定。在加标试验负富集后，在肌酸激酶(CK)抗体的单阳性鉴定中，MDA-MB468、MDA-MB453和MDA-MB231细胞的回收率分别为19.3%、29.6%和25.6%。在CK和TROP2抗体的双阳性试验中，回收率分别为16.9%、30.2%和25.3%(图4D)。结合先前描述的TROP2在TNBC中的高表达及其影响EMT的能力，研究结果表明TROP2有可能成为鉴定TNBC CTC的辅助标志物，从而有助于检测更具转移潜力的CTC。

▲图4 TROP2在TNBC细胞和血细胞中的表达

5 TROP2在TNBC CTC中的高表达及其检测间质相关CTC的潜力

使用益善的CanPatrol^® CTC检测平台来验证TROP2作为TNBC患者血液样本中新CTC标记物的候选分子的临床适用性。化验平台的工作流程如图5A所示。接下来，使用加标测定来验证在CanPatrol CTC测定平台中通过RNA原位杂交(RNA-ISH)测定检测到的标准TNBC细胞系的TROP2表达结果。

TROP2在不同的TNBC细胞中被高度释放(图5B)，这与图2A所示的qRT-PCR结果基本一致，证明了使用CanPatrol^®CTC检测平台通过TROP2检测临床血液CTC的可行性。此外，结果显示TROP2的表达水平与间充质标记物波形蛋白呈正相关，尤其是在MDA-MB231和MDA-MB468细胞中(图5E)。然后使用CanPatrol^® CTC测定平台对总共39个血液样本中的CTC进行计数和分型，包括luminal、HER2+BC患者和TNBC。管腔、HER2+BC和TNBC中不同类型CTC与总CTC的比率如图5F所示。在TNBC患者中，混合上皮-间充质CTC比例更多。此外，TROP2在患有TNBC的CTC患者中表达更高，在HER2+患者中表达较低，尽管TROP2的表达水平在管腔BC患者的CTC中也很高，并且与临床病理肿瘤分析联合会(CPTAC)数据库信息(图1B)和BC细胞qRT-PCR结果(图2A)一致。具体来说，我们分析了每种BC亚型的典型病例。TNBC患者(P3030)的CTC中TROP2表达水平显著高于HER2+患者(P4187)。尽管在管腔BC患者的CTC中检测到较高的TROP2表达(P2997)，但其显著低于TNBC患者(图5C)。更有趣的是，我们发现在TNBC患者中，TROP2在上皮CTC中不表达或低水平表达，并且随着TNBC的增加而高表达混合上皮-间充质CTC中EMT的水平。TROP2的表达水平与间充质标志物的表达水平呈正相关，如图5D所示，表明TROP2有潜力检测TNBC患者中的间充质相关CTC。

▲图5 TROP2在TNBC CTC中的高表达及其检测间充质相关CTC的潜力

研究结论

该研究表明，TROP2在TNBC中特别高表达，并促进BC细胞的迁移和侵袭。TROP2作为TNBC中EMT CTCs的潜在生物标志物的特异性和应用性在细胞系和临床血液样本中得到了验证。未来的研究是需要提供更多关于与抗TROP2 ADC伴随诊断和检测更多类型CTC相关的液体活检的数据。

参考文献：

1.Wang, Q., Armenia, J., Zhang, C., Penson, A.V., Reznik, E., Zhang, L., Minet, T., Ochoa, A., Gross, B.E., Iacobuzio-Donahue, C.A., et al. Unifying cancer and normal RNA sequencing data from different sources. Sci Data. 2018 Apr 17:5:180061.

2.Zhao, W., Jia, L., Kuai, X., Tang, Q., Huang, X., Yang, T., Qiu, Z., Zhu, J., Huang, J., Huang, W., and Feng, Z.. The role and molecular mechanism of Trop2 induced epithelial-mesenchymal transition through mediated b-catenin in gastric cancer. Cancer Med. 2019 Mar;8(3):1135-1147.

3.Qingyu Liao , Ruiming Zhang, Zuli Ou, Yan Ye, Qian Zeng, Yange Wang, Anqi Wang, Tingmei Chen, Chengsen Chai, Bianqin Guo. TROP2 is highly expressed in triple-negative breast cancer CTCs and is a potential marker for epithelial mesenchymal CTCs. Mol Ther Oncol. 2024 Jan 10;32(1):200762.