学术成果 | CTC EMT分型联合ERCC1：新的鼻咽癌预后标志物

鼻咽癌(NPC)是一种起源于鼻咽黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，有着独特的地理分布特征，在东亚和东南亚、北极、北非和中东等地区发病率很高^{[1, 2]}，在我国华南区域广东、广西发病率高。随着治疗模式的不断进步，局部晚期鼻咽癌患者(没有转移)治疗后的5年生存率通常在70%-90%之间^[3-4]，然而，仍有一个占比10-25%的显著亚群，预后较差，易出现远处转移和区域复发，预后较差^[5-7]。因此，寻找鼻咽癌鉴定、疗效、预后相关的生物标志物尤为重要。

循环肿瘤细胞(CTCs)的检测已成为临床癌症诊断和监测的有效工具。核苷酸切除交叉修复基因1(ERCC1)和CTC上皮间质转化(EMT)的表达与治疗效果有关。通过CTCs表型及ERCC1表达检测，对深入研究鼻咽癌临床预后相至关重要。

广西医科大学第一附属医院放疗科基于CanPatrol^® CTC分型检测技术平台对CTCs的计数、EMT分型及EMT亚型上的ERCC1表达与检测与局部晚期鼻咽癌(laNPC)预后相关性进行了研究探索^[8]，旨在评估鼻咽癌治疗前CTC及其EMT亚型上ERCC1表达的预后意义。

01 纳入人群

本研究纳入2018年11月至2021年11月期间接受CanPatrol^® CTC检测的108名新诊断为局部晚期鼻咽癌的患者。

纳入标准：(1) 组织病理学诊断为NPC，(2) 第八版UICC/AKCC分期系统分类为III-IVa期，(3) 无抗肿瘤治疗或其他恶性肿瘤的既往史，(4) Karnofsky绩效评分≥70，(5) 成功完成规定的放射治疗方案。

排除标准：(1) 存在严重的潜在疾病，如心血管疾病、未控制的糖尿病或精神障碍，(2) 因无关原因导致放射治疗中断或未能坚持计划治疗。

02 研究方法

在治疗前，使用EDTA抗凝采血管，采集两管5ml外周血，采用CanPatrol^®CTC可视化液体活检平台对外周血中CTC的数量、类型及ERCC1表达情况进行检测。该技术采用不依赖特定标志物的纳米膜分离方法，全面富集所有类型的CTCs及CTC细胞团；通过多重mRNA荧光原位杂交法，使用多组上皮、间质和CD45探针、ERCC1特异性探针，对富集的CTCs进行EMT分型和鉴定、ERCC1表达检测(图1)，实现CTCs的EMT分子分型和ERCC1表达检测。

▲图1 不同EMT亚型CTCs和CTCs ERCC1的荧光显微图像

A. 上皮型和ERCC1阴性CTC(红色荧光); B. 混合型和ERCC1阴性CTC(红+绿荧光); C. 间充质型和ERCC1阴性CTC(绿色荧光); D. 上皮型和ERCC1阳性CTC(红色+紫色荧光); E. 混合型和ERCC1阳性CTC(红+绿+紫色荧光); F. 间充质型和ERCC1阳性CTC(绿色+紫色荧光)

03 疗效评估

在治疗结束和治疗后3个月，对所有患者进行疗效评估，使用在初始阶段采用的相同诊断成像方式诊断(包括CT、MRI、US和PET)，评估治疗效果。采用实体瘤反应评估标准(RECIST)对疗效进行分类，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病进展(PD)和疾病稳定(SD)^[9]。

04 随访

治疗结束后，入组人群在2年内每3个月进行一次随访。常规检查包括体格检查、血液生化检查、鼻咽镜检查、头颈部MRI扫描、胸部CT、ECT和腹部超声。若检测到任何异常，需进行额外的评估，如病理活检或PET/CT扫描。在治疗完成后的2至5年内，随访时间调整为每6个月随访一次。

05 统计分析

使用SPSS Statistics 23.0版(IBM Corp.，Chicago)进行统计分析。使用卡方检验对临床特征分类组间的差异进行检验。通过生成Kaplan-Meier生存曲线进行生存分析，使用对数秩进行评估。在所有统计分析中，P<0.05具有统计学意义。

06 研究结果

1 患者的临床病理特征

本研究回顾性分析108名患者新诊断为laNPC的患者。在108名患者中，100例患者CTC呈阳性，其中70名是男性，30名女性，中位年龄为44岁(17-69岁)。根据世界卫生组织(WHO)病理分类，所有患者诊断为非角化癌。根据第八UICC/AJCC TNM分期系统，38例患者为III期，62例为IVa期^[10]。根据N期，53例为N0-1期，47例为N2-3期。根据T分期，54例被归类为T2-3，46例为T4。所有100名患者未检测到转移(归类为M0阶段)。在这些患者中，38人有吸烟史。此外，在96名接受EBV检查的患者中，92名EBV呈阳性。具体临床特征见表3。

表3 鼻咽癌患者的临床特征

2 CTC ERCC1表达及其临床特征

CTC阳性率为93%(100/108)，EMT分类和ERCC1表达分类见表4。

100名CTC阳性患者亚组中，ERCC1阳性率为74%(74/100)。在组间分析中，结果表明ERCC1表达与临床特征之间没有显著相关性(表3)。CTC EMT亚型的ERCC1表达分析发现，间质型CTC ERCC1的表达与患者的N分期显著相关(P=0.01)。上皮型和混合型CTC ERCC1与患者N分期无关(P>0.05)。此外，ERCC1表达与性别、年龄、T分期、TNM分期和吸烟状况等其他临床特征之间没有显著相关性(表3)。

表4 CTC EMT亚型和 ERCC1表达

3 CTC ERCC1表达与治疗疗效相关性

在100名CTC检测呈阳性的患者队列中，47名患者(47%)在治疗结束时达到CR，53名患者(53%)达到PR。治疗后3个月，80名患者(80%)达到CR，20名患者(20%)达到PR。

对CTC上ERCC1的表达和治疗反应进行亚组分析，结果显示，治疗结束时，ERCC1阳性亚组的CR率(30/74，40.5%)明显低于ERCC1阴性亚组(17/26，65.4%)(P=0.025)(表5)。治疗3个月后，ERCC1阳性亚组的CR率(55/74，74.3%)低于ERCC1阴性亚组(25/26，96.2%)，差异具有统计学意义(P=0.021)。

此外，治疗结束时，间质型CTC ERCC1阳性亚组的CR率(8/29，27.6%)低于ERCC1阴性亚组(39/71，54.9%)，差异具有统计学意义(P=0.016)。治疗3个月后，ERCC1阳性亚组的CR率(19/29，65.5%)低于ERCC1阴性亚组(61/71，85.9%)，差异具有统计学意义(P=0.028)。在上皮型和杂交型CTC中，没有观察到ERCC1表达与治疗疗效之间存在相关性(表5)。

表5 鼻咽癌患者CTCs ERCC1表达与临床疗效的相关性

4 CTC ERCC1表达与预后

对100名CTC阳性患者进行随访，中位随访时间为32个月(10至58个月)。3年总生存率(OS)、无病生存率(DFS)、无复发生存率(RFS)和无转移生存率(MFS)分别为89%、82%、93%和85%。

进一步分析CTC ERCC1表达与患者预后之间的关系，研究发现CTC上ERCC1表达与更差OS(P=0.039)(图2)和DFS(P=0.035)(图3)之间显著相关。ERCC1表达与RFS或MFS之间没有显著相关性。评估ERCC1表达与EMT亚型预后的关系，结果显示，间质型CTC ERCC1表达与较差的DFS(P=0.012)(图4)以及MFS(P=0.001)(图5)显著相关，未观察到与OS和RFS有显著关联。此外，T期、N期、TNM期、上皮和混合型CTC上ERCC1的表达与患者预后之间没有显著相关性(表6)。

▲图2 CTC ERCC1表达与OS的Kaplan-Meier生存曲线

▲图3 CTC ERCC1表达与DFS的Kaplan-Meier生存曲线

▲图4 间质型CTC ERCC1表达与DFS的Kaplan-Meier生存曲线

▲图5 间质型CTC ERCC1表达与MFS的Kaplan-Meier生存曲线

表6 鼻咽癌患者预后因素Kaplan-Meier分析

07 研究结论

该研究表明，间充质CTCs上ERCC1阳性与晚期N分期有关(P=0.01)。ERCC1表达与较差的总生存期和无病生存期相关。间充质型CTC上ERCC1阳性与较差的OS和MFS显著相关。CTC分型检测及CTC上ERCC1的表达可能成为鼻咽癌患者新的预后标志物，CTC亚型可能作为定制个性化和精确治疗策略的助手的潜力，对实现鼻咽癌个体化治疗具有重要的临床价值。

参考文献：

1.Chang ET, Ye W, Zeng Y-X, Adami H-O. The evolving epidemiology of nasopharyngeal carcinoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2021;30(6):1035-1047.

2.Chen Y-P, Chan ATC, Le Q-T, Blanchard P, Sun Y, Ma J. Nasopharyngeal carcinoma. Lancet. 2019;394(10192):64-80.

3.Wong KCW, Hui EP, Lo K-W, et al. Nasopharyngeal carcinoma: an evolving paradigm. Nat Rev Clin Oncol. 2021;18(11): 679-695.

4.Lee AWM, Ma BBY, Ng WT, Chan ATC. Management of nasopharyngeal carcinoma: current practice and future perspective. J Clin Oncol. 2015;33(29):3356-3364.

5.Chen Y-P, Liu X, Zhou Q, et al. Metronomic capecitabine as adjuvant therapy in locoregionally advanced nasopharyngeal carcinoma: a multicentre, open-label, parallel-group, randomised, controlled, phase 3 trial. Lancet. 2021;398(10297): 303-313.

6.Zhang Y, Chen L, Hu G-Q, et al. Gemcitabine and cisplatin induction chemotherapy in nasopharyngeal carcinoma. N Engl J Med. 2019;381(12):1124-1135.

7.Sun Y, Li W-F, Chen N-Y, et al. Induction chemotherapy plus concurrent chemoradiotherapy versus concurrent chemoradiotherapy alone in locoregionally advanced nasopharyngeal carcinoma: a phase 3, multicentre, randomised controlled trial. Lancet Oncol. 2016;17(11):1509-1520.

8.Liu T, Li YQ, Song JM, Li B, Wang RS, Huang TT, Qin YT, Prognostic Significance of Excision Repair Cross-Complementation Group 1 on Circulating Tumor Cells for Nasopharyngeal Carcinoma.Cancer Control. 2024 Jan-Dec:31:10732748241251562.

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